| 名医在线 建立阿尔茨海默症的转基因动物模型 解剖学报 2000年第2期第0卷 论著 作者：常洋 秦川 尹红星 朱华 蔡有余 单位：常洋 秦川 尹红星 朱华 蔡有余（中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所，北京 100021） 关键词：阿尔茨海默症；app；转基因；模型 【摘要】 目的 建立阿尔茨海默症转基因动物模型，为病因研究和药物筛选提供了一个合适的动物模型。 方法 通过显微注射方法将外源dna注射到小鼠受精卵的雄性原核，移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后，经pcr及pcr-southern杂交检测阳性小鼠。 结果 共注射887枚受精卵，存活482枚，移卵后产仔35只，阳性3只。阳性鼠分别传代，在f2代获得纯合子后建系。免疫组织化学显示在大脑皮层、小脑及海马的神经细胞有aβ沉淀形成。 结论 通过显微注射的方法已建立与人类发病机理相似的阿尔茨海默症转基因动物模型。 【中图分类号】 q75 【文献标识码】 a 【文章编号】 0529-1356(2000)02-144 establishment of the transgenic model of alzheimer disease chang yang, qin chuan, yin hong-xing, zhu hua, cai you-yu (institute of laboratory animal science, chinese academy of medical sciences, beijing 100021,china) 【abstract】 objective to establish a transgenic model of alzheimer disease.methods we constructed the transgene containing the human app cdna 695 v717i driven by pdgf promoter which expresses specifically in nervous system. the transgene was microinjected into the male pronucleus of the zygotes. the tail dna of pups was tested by pcr and southern blot.results 887 embryos were microinjected, 482 were implanted to 20 recipient pseudopregnant mice, 3 of 35 pups carrying the transgene. each heterozygous founders generated a transgenic line that was homozygous for the transgene. immunocytochemistry revealed plaques in pallium, cerebellum, and hippocampus. conclusions resembling animal model of the human pathogenic mechanism for the screening of proper remedies established in our laboratory and could be used for further studied. 【key words】 alzheimer disease; app; transgene; model 阿尔茨海默症(alzheimer disease,ad)是进行性神经降解性疾病，通常表现为记忆丧失。其基本病理表现是由于app在脑部的异常代谢产生的38～42个氨基酸的有神经毒性的多肽(aβ,β／a4)沉积在大脑皮层和海马结构，形成β-淀粉样斑块［1］。动物模型的缺少已经成为ad发病机理研究及药物筛选的主要障碍。虽然化学方法，免疫方法甚至将多肽直接注入啮齿类动物脑内的努力都已尝试，但都不是很理想［2］。1980年cordon等［3，4］以玻璃针刺进受精卵的雄原核，注入dna溶液，成功地获得转基因动物。利用转基因技术复制人类疾病动物模型，已成为一个主要发展方向。 我们以pdgf启动子调控app cdna构建转基因，通过显微注射进入小鼠受精卵的雄性原核。通过pcr及southern杂交检测获得阳性小鼠，现在正在传代建系。 材料和方法 1.转基因片段的制备 含有全长突变的人app cdna695 v717i受控于pdgf启动子调控的质粒ppdap695由本课题组构建［5］。质粒ppdap695的tth111i+xbai的酶切片段为4.1kb，透析袋法进行回收。氯化铯超离纯化，于20℃、40 000r/min离心48h。分步收集，将含有dna的溶液合并，在注射缓冲液中透析。注射缓冲液含7.5mmol/l tris(ph7.4)与0.175 mmol/l edta。 2.转基因操作 2.1 限制性内切酶及主要生化试剂：限制性内切酶及tap dna聚合酶购于promega公司及华美生物工程公司。一般化学试剂均为国产分析纯。乳酸钠、透明质酸酶、矿物油、bsa等均购于sigma公司(embryo tested)。孕马血清(pms)购于天津市华孚高新生物技术公司，人绒毛膜促性腺激素(hcg)为上海生物化学制药厂生产。 2.2 动物品系：种公鼠为bdf1，10周龄以上。供卵鼠为km，4～5周龄，体重12～16g。结扎公鼠为km／icr，10周龄以上。受体鼠(假孕鼠)为km／icr,8周龄以上，体重30g以上。 2.3 主要仪器：倒置显微镜(nikon)、显微操作系统(narishige)、解剖镜(nikon)钟表镊(swiss)、co2孵箱、dna合成仪(pe480)。 2.4 超排卵和取卵：供卵鼠于明暗循环的明循环中点腹腔注射pms 10 iu,46h后注射hcg 10iu，并与公鼠合笼，次日晨将有阴栓的母鼠处死。取输卵管在膨大部划出卵团，加透明质酸酶消化，挑出受精卵于m16继续培养4h。 2.5 显微注射gd-1管在水平拉针仪(model pn-30,narishige japan)拉成注射针。拉针条件：heater level：70.4，magnet sub：22.1，magnet main：59.6。注射针末端虹吸dna溶液后，于400倍镜下注入受精卵雄性原核。注射浓度2mg/l。 2.6 移卵：受精卵注射后在m16继续培养2～4h，挑选生长状态较好的卵，进行移卵。每只假孕鼠输卵管单侧移卵约30枚。 3.转基因鼠的鉴定及传代建系 3.1 提取鼠尾dna：仔鼠乙醚麻醉后，剪1.0～1.5cm鼠尾，在裂解溶中剪碎后，加蛋白酶k消化过夜。酚、氯仿抽提，乙醇沉淀、漂洗，晾干后加150μl te溶解。 3.2 鼠尾dna的pcr检测：取1～2μl鼠尾dna进行pcr反应。本实验共设计两对引物，分别位于转基因片段的5’端和3’端(图1)。 1 app 695转基因构建及pcr引物设计图 fig.1 construction of app 695 transgene and design of pcr primers p1为5’-gtcacccctagttcttttt-3',p2 5'-ggtagacttcttggcaatac-3',pcr循环：94℃5min预变性；94℃ 1min,57℃1min，72℃ 1min，30个循环；72℃延长10min。 p3为5’-ggtgggcggtgttgtcat-3',p4为5’-acctccccctgaacctgaaa-3’，pcr循环：94℃ 5min预变性；94℃30s，57℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃延长10min。 3.3 pcr-southern p3、p4引物对扩增产物选用dig高效随机引物标记与检测试剂盒i(b.m.)进一步检测。 3.4 转基因鼠建系 首建鼠与c57bl交配，产生f1代。f1代阳性鼠同窝互交，在f2代检测纯合子。 4. 病理学检查 标本经4%中性甲醛固定，常规石蜡切片，免疫组织化学采用abc法。abc试剂盒为vector公司产品，一抗为小鼠抗人aβ单克隆抗体，1∶200倍稀释。 |
